La neurotoxina botulínica (NTBo) tipo A, producida por Clostridium botulinum (Cb), es el serotipo prevalente en cepas de suelos de Mendoza. El suelo (Su) es el principal reservorio de las esporas de microorganismo, y posiblemente la principal fuente de infección para los lactantes, produciendo botulismo del lactante (BL). Esta forma fisiopatológica es la de mayor incidencia en ArgentinaEn estudios anteriores nosotros encontramos que las cepas obtenidas de Su y heces de casos BL difieren en la morfología de sus colonias, en algunas propiedades biológicas de su NTBo, como también en la actividad proteolítica de las NTBo frente a proteínas SNARE. Se observó correlación entre una mayor actividad tóxica y de escisión de SNAP 25 y VAMP 2 por parte de las cepas de Su, con respecto a cepas de BL y prototipo A Hall, esta última característica sin precedentes.Ambas NTBo de Su y BL presentaron un peso molecular de ≈ 300 KDa, correspondiendo al complejo no tóxico no hemaglutinante (M), a diferencia de lo que ocurre en otros lugares del mundo donde predominan las cepas productoras de NTBo de ≈ 900 y 600 KDa respectivamente, con la fracción hemaglutinante (LL y L) . Varios autores sugieren el ingreso de la NTBo a las células intestinales por medio de la fracción hemaglutinante, lo que llevaría a plantear para nuestras toxinas otras vías de internalización. Este proyecto propone el estudio de las vías de ingreso de la NTBo de cepas autóctonas de Su en distintas líneas celulares de carcinoma colorrectal.El esclarecimiento de este mecanismo podría ser parte de estudios posteriores de bloqueo de la absorción intestinal de la NTBo.

Palabra claves: Neurotoxina botulinuca, Botulismo, Células de carcinoma colorrectal

Botulinum neurotoxin type A, produced by Clostridium botulinum (Cb) is the serotype prevalent in strains of Mendoza?s soils. The soil (Su) is the main reservoir of microorganism spores, and possibly, the main source of infection for infants, causing infant botulism (BL). This pathophysiological form, is the most prevalent in Argentina.In previous studies, we found that the strains obtained from Su and BL feces, differ in the morphology of their colonies, some biological properties of the BoNT as well as in the proteolytic activity of BoNT against SNARE proteins. Correlation is observed between a higher toxic activity and cleaving VAMP 2 and SNAP 25 by strains of Su, compared with BL strains and prototype A Hall, this last feature unprecedented. Both, BoNT Su and BL showed a molecular weight of ≈300 kDa, corresponding to non-toxic no hemagglutination complex (M), unlike what happens in other parts of the world where the producing strains of ≈ 900 and 600 kDa predominate, with the hemagglutinating fraction (NTH) (LL and L).While some authors have suggested that the NTH component is required for the internalization of the BoNT into cells of the intestinal epithelium, our observations suggest that there may be other routes of internalization. We propose the study of the routes of entry of BoNT from autochthonous Su strain in different cellular lines of colorectal carcinoma. The elucidation of this mechanism could be part of further studies of blocking intestinal absorption of BoNT.

Keywords: Botulinum neurotoxins, Botulism, Colorectal carcinoma cells

La hipertensión arterial (HTA) es una condición médica considerada uno de los problemas más importantes de salud pública en países desarrollados, afectando a cerca de mil millones de personas a nivel mundial. En tal sentido, el estudio sobre mecanismos, desarrollo, mantenimiento y tratamientos de la HTA resultan prioritarios. Los factores contribuyentes incluyen: ingesta sódica, renina, resistencia a la insulina, apnea durante el sueño, edad y genética. Al respecto, se han estudiado muchos genes, pero sin embargo las alteraciones genéticas no han sido plenamente esclarecidas. De interés, el daño renal es un evento significativo en el desarrollo de la HTA y consistente con esto ha sido recientemente demostrado que la restricción de alimentos maternos altera la expresión génica fetal de factores de transcripción relevantes para la organogénesis renal como WT-1 y esto parece contribuir con el desarrollo de HTA. Las mutaciones de WT-1 pueden conducir a HTA. Por otro lado, resultan escasos los antecedentes de estudios que evalúen el proceso nefrogénico asociado con la expresión de WT-1 y el desarrollo de HTA. En consecuencia, el presente proyecto propone estudiar la expresión de WT-1 y factores relacionados con el desarrollo renal durante el establecimiento de la HTA así también como el correspondiente correlato anatomo-funcional. La concreción de nuestros objetivos, permitirían sugerir un inédito vínculo, mecanístico/regulatorio, de WT-1 sobre la alteración de procesos nefrogénicos y su relación con el desarrollo de la HTA. De ser así, se podría postular que la desregulación en la expresión de WT-1 y factores asociados, produciría consecuencias sobre la inducción de fibrosis y apoptosis, la transición epitelial mesenquimatosa, además de procesos de embriogénesis reversa, número y tamaño de glomérulos y elevación de la presión arterial; lo cual podría ser determinante en el conocimiento sobre el desarrollo y mantenimiento de la hipertensión esencial.

Palabra claves: hipertensión arterial, enfermedad renal, apoptosis

Hypertension (HTA) is a medical condition considered one of the most important public health problems in developed countries, affecting nearly one billion people worldwide. In this sense, the study of mechanisms, development, maintenance and treatment of hypertension are priorities. Contributing factors include: sodium intake, renin, insulin resistance, sleep apnea, age and genetics. In this respect, many genes have been studied, but nevertheless genetic alterations have not been fully elucidated. Of interest, the kidney damage is a significant event in the development of hypertension and consistent with this has been recently shown that restricting maternal food alters the fetal gene expression of factors relevant transcription for renal organogenesis as WT-1 and this it seems to contribute to the development of hypertension. The WT-1 mutations can lead to hypertension. On the other hand, are limited history of studies evaluating the nephrogenic process associated with the expression of WT-1 and the development of hypertension. Consequently, this project aims to study the expression of WT-1 and factors related to kidney development during the establishment of hypertension as well as the corresponding anatomical and functional correlation. The realization of our goals, allow suggest an unprecedented link, mechanistic / regulatory, WT-1 on nephrogenic alteration processes and their relationship with the development of hypertension. If so, one could postulate that deregulation in the expression of WT-1 and associated factors produce consequences on the induction of fibrosis and apoptosis, the mesenchymal epithelial transition, in addition to processes of reverse embryogenesis, number and size of glomeruli and elevation blood pressure; which could be decisive in the knowledge about the development and maintenance of essential hypertension.

Keywords: hypertension, renal disease, apoptosis

Este proyecto es continuación del desarrollado en 2013-2015. Si bien se planteaba la obtención del producto final liofilizado, este objetivo no pudo cumplirse por la no disponibilidad de un equipo adecuado en el medio y su elevado costo para adquirirlo. No obstante, durante su desarrollo se tramitó y concretó la compra e importación de un equipo liofilizador de escala piloto y baja producción (600 viales por lote). La inoculación intramuscular de NTBo para tratamiento de desórdenes de la tonicidad muscular se realiza desde el año 1980, principalmente para el tratamiento del estrabismo, blefaroespasmo, tortícolis, disfonías, espasmo hemifacial y otras afecciones(1-14). La simplicidad del tratamiento lo hace una excelente alternativa a la cirugía no siempre exenta de riesgos o complicaciones. La acción principal es una parálisis muscular flácida, que permite la recuperación de la funcionalidad, que requiere entre 2 y 6 meses para su recuperación (duración de la acción farmacológica). En cuanto al rango terapéutico, la NTBo superaría en seguridad a la mayoría de las drogas. En esta última década el uso de la terapia con NTBo ha experimentado un asombroso crecimiento, con nuevas y múltiples indicaciones, especialmente neurológicas, y se ha convertido en el tratamiento de medicina estética con más rápido crecimiento en su demanda. La propuesta consiste en la producción de una preparación de NTBo tipo A, adecuadamente purificada y estandarizada, y de óptima estabilidad, para uso humano, y considerar además su uso en veterinaria. Sería ideal obtener preparados que durante la elaboración y almacenamiento la toxicidad no disminuya significativamente (elevada actividad específica: Unidades de toxina/mg de proteína), pudieran almacenarse a temperatura ambiente, mantengan mayor tiempo la actividad y con adecuada capacidad de difusión y mínima respuesta de anticuerpos. El efecto no es instantáneo, sino progresivo en los primeros días y óptimo entre 1 y 2 semanas después. Entre 3 y 4 meses más tarde, el efecto empieza a menguar y los músculos vuelven a contraerse. El resultado no es la cura definitiva necesitándose dosis repetidas. Su uso está limitado actualmente por el elevado costo de los productos importados del mercado. La disposición de un producto nacional equivalente al líder actual en el mercado y de precio significativamente inferior permitirá una mayor cobertura de la población de bajos recursos.

Palabra claves: Toxina botulínica, Uso farmacológico, Neurología. Traumatología. Dermatología. Estética

This project is a continuation of developed in 2013-2015. Although it was planned obtaining the lyophilized final product, this goal was not met by the unavailability of suitable equipment in Mendoza, and high cost to acquire it. However, during the development of that project, it was processed and completed the purchase and importing an lyophilizer equipment, for pilot fase and low scale production (600 vials per batch). The intramuscular injection of BoNT for the treatment of disorders of the muscle tone is carried out since 1980, primarily for the treatment of strabismus, blepharospasm, torticollis, dysphonia, hemifacial spasm and other conditions (1-14). The simplicity of treatment makes it an excellent alternative to not always without risk or complications surgery. The main action is a flaccid muscle paralysis, which allows the recovery of functionality, which requires between 2 and 6 months for recovery (duration of drug action). Regarding the therapeutic range, BoNT exceed safety to most drugs. In the last decade the use of BoNT therapy has experienced an amazing growth with multiple new indications, especially neurological, and has become the treatment of aesthetic medicine with faster growth in demand. Our proposal involves the production of a preparation of BoNT type A, properly purified and standardized, and optimum stability, for human use, and also consider their use in veterinary medicine.

Keywords: Botulinum toxin, Therapeutic use, Neurology. Traumatology. Dermatology. Esthetic

Durante las últimas décadas se han reportado avances en relación a los mecanismos patogénicos de las enfermedades autoinmunes. Sin embargo, aún no se han desarrollado terapias específicas para trastornos autoinmunes sistémicos como Lupus Eritematoso Sistémico o Artritis Reumatoide. La identificación de nuevos mecanismos patogénicos autoinmunes permitirán diseñar terapias efectivas que reduzcan la respuesta autorreactiva y resguarden la competencia del sistema inmune. La alta incidencia de enfermedades autoinmunes sobre el sexo femenino sugiere que las hormonas femeninas son un factor de riesgo considerable. Estudios en humanos indican que existe una asociación entre hiperprolactinemia y enfermedades autoinmunes sugiriendo así un rol importante de prolactina (PRL) en estos trastornos. Las acciones de PRL están mediadas por su receptor (PRL-R) que puede tener diferentes isoformas incluyendo una isoforma larga (PRL-RL) formado por un dominio extracelular, uno transmembrana y uno transductor de señales intracelulares. La isoforma corta (PRL-RC) carece del dominio citoplasmático y por consiguiente no posee señalización intracelular. Las isoformas PRL-RC y PRL-RL se encuentran co-expresadas en diferentes tejidos incluyendo órganos linfáticos. Sin embargo heterodímeros formados por PRL-RL y PRL-RC son funcionalmente inactivos. Aunque la regulación de las diferentes isoformas del PRL-R ha sido estudiada extensivamente en el tracto reproductor femenino, su expresión en linfocitos T durante enfermedades autoinmunes es indiscutiblemente desconocida. Debido a que alteraciones en la activación de linfocitos T podrían contribuir al desarrollo de autoinmunidad, la identificación de nuevos blancos terapéuticos relacionados con estas células es de vital importancia para el diseño de nuevas terapias y marcadores pronósticos de la enfermedad. Nuestra hipótesis es que existirían fallas en la expresión de las distintas isoformas del PRL-R que resultarían en alteraciones de la modulación de linfocitos T durante su activación influyendo en la susceptibilidad a desarrollar enfermedades autoinmunes. En este plan de trabajo evaluaremos la expresión de las diferentes isoformas del PRL-R en linfocitos T en estado basal, activado y durante el desarrollo de autoinmunidad utilizando modelos murinos para enfermedades autoinmunes. Los datos que arroje este proyecto contribuirán a la comprensión de las interacciones entre el sistema inmune y endócrino en la salud y en la enfermedad.

Palabra claves: linfocitos T, autoinmunidad, prolactina

Over the past decades much progress has been done in relation to the pathogenic mechanisms of autoimmune diseases. However, scientific research has not yet developed specific therapies for autoimmune disorders such as systemic lupus erythematosus or rheumatoid arthritis. The identification of novel autoimmune pathogenic mechanisms will allow the design of effective therapies that may reduce self-reactive responses during autoimmunity and safeguard the competence of the immune system. The high incidence of autoimmune diseases of the female suggests that female hormones are a significant risk factor. Human studies indicate that there is an association between hyperprolactinemia and autoimmune diseases thus suggesting an important role of estrogens and prolactin (PRL) in these disorders. The effect of PRL are mediated by its receptor (PRL-R) that can have different isoforms including a long isoform (PRL-RL) comprising an extracellular domain, a transmembrane and intracellular signal transducer one. The short isoform (PRL-RC) lacks the cytoplasmic domain and therefore has no intracellular signaling. The PRL-RC and PRL-RL isoforms are co-expressed in different tissues including lymphatic organs. However heterodimers formed by PRL-RL and PRL-RC are functionally inactive. Although regulation of the different isoforms of PRL-R has been studied extensively in the female reproductive tract, their expression in T cells during autoimmune diseases it is unquestionably unknown. Because alterations during T cell activation may contribute to the development of autoimmunity, identification of new therapeutic targets related to these cells is crucial for the design of new therapies and prognostic markers of the disease. Our hypothesis lays that alterations in modulating the expression of the different isoforms of PRL-R during T cell activation may influence the susceptibility to autoimmunity. In this work plan we will evaluate the expression of different isoforms of PRL-R in T cells in basal state, after cellular activation and during autoimmunity using mouse models for autoimmune diseases. Data obtained from our project will contribute to the understanding of the interactions between the immune and endocrine system in health and disease.

Keywords: T cells, autoimmunity, prolactin

La epigénesis se reconoce como uno de los componentes más importantes en la regulación de la función génica En estudios previos realizados en nuestro laboratorio, se encontró en niños de una determinada zona geográfica, caracterizada por la abundancia de yacimientos minerales en la provincia de La Rioja, alteraciones fenotípicas en la expresión del gen HSR. Este gen se ha asociado con dominancia para el uso de la mano derecha, asimetría cerebral, habilidades cognitivas relacionadas con lecto-escritura y susceptibilidad a padecer esquizofrenia. El análisis del patrón de metilación del genoma de estos niños mostró. Se consideró la hipótesis que la regulación epigenética del gen HSR es modificada por influencias ambientales y que la abundancia de elementos traza podrían ser el factor exógeno involucrado en esta regulación. Posteriormente se encontró en ratas tratadas con Te en el agua de beber, modificaciones similares a las encontradas en los niños de esta provincia, en pruebas conductuales que en su conjunto pueden ser extrapolables a la expresión del gen HSR en humanos. El estudio molecular del ADN extraído de los hipocampos del cerebro de las ratas mostró la misma variación en la proporción de citosinas metiladas respecto de las citosinas no metiladas, sugiriendo una alteración epigenética idéntica a la de los humanos.Ulteriormente se encontró que la administración crónica de ZnTe a ratas madre y posteriormente a sus hijos en forma conjunta con Se, las modificaciones conductuales inducidas por Te fueron contrarrestadas por Se tales como pruebas de interacción social; exploración lateralizada y motivada por la novedad; defensa y supervivencia. Considerando el papel que Se tiene en el organismo como elemento esencial, surge la hipótesis que este elemento podría también modular fisiológicamente los procesos cerebrales de memoria y emocionalidad. Esta posibilidad hasta ahora no ha sido estudiada y podría afectarse por la administración de Te.El propósito de la continuación del presente proyecto es analizar si los procesos cognitivos y los mecanismos emocionales mencionados en la rata, están modulados por Se y afectados por Te.

Palabra claves: epigénesis, elementos traza, selenio

Cell homeostasis is regulated by complex mechanisms. One of these mechanisms is modulation of gene expression by epigénesis, process known to be one of the most important factors in the regulation of gene expression. Previously in our laboratory, children coming from a determined geographical region, rich in metal and non-metal deposits in La Rioja province, Argentine, presented phenotypic alterations of the HSR gene expression. This gene locus has been associated to handedness, brain asymmetry, writing-reading capacities, and susceptibility to develop schizophrenia. Molecular analysis of methylation patterns of DNA in the blood of these children showed alterations when compared to control children from other region. Since one of the mechanisms of epigénesis is regulation of methylation of DNA, hypothesis that the epigenetic influence on HSR is mediated by environmental factors such as the presence of trace elements was considered. In subsequent experiments in rats subjected to a chronic regimen of Te ingestion in drinking water at the same concentration of that found in water and soils of La Rioja, changes in behaviours equivalent to that found in humans and alteration of the methylation DNA patterns were found. The most outstanding finding was that altered methylation patterns of DNA in the hippocampus structure and not in the prefrontal cortex of Te-treated animals. Possibility that Te could interferes with other essential element, was considered in the previous research project. Then, the interaction of Se with Te was studied, and experiments showed that Se was able to counteract almost all effects induced by the Te treatment, suggesting that Te might be swapping with Se. The principal affected behaviours and restored to normal were social interaction, lateralized exploration and survival responses. It is known that these important behavioral responses are linked to two primary brain processes, learning/memory and emotionality. Possibility that trace elements might be affecting these neural mechanisms has not been studied.The objective of the present study is to evaluate if Se has a modulating role on cognition and emotionality, and if the interaction with Te could also affect these primary processes.

Keywords: epigenetics, trace elements, selenium

En proyectos anteriores este laboratorio ha mostrado en ratas que los elementos inorgánicos, como Zn y Te, son capaces de alterar la normal expresión conductual de algunas funciones superiores del cerebro, de una manera similar a lo encontrado previamente en humanos. Tres aspectos de estas funciones fueron afectadas, respuestas conductuales cognitivas; respuestas naturales de interacción social y respuestas de defensa y de supervivencia.El presente proyecto, continuación de la línea de trabajo anterior, pretende en esta nueva etapa encontrar evidencias que permitan fortalecer la idea que los elementos traza son moduladores epigenéticos de la expresión comportamental de adecuación y enfrentamiento. Particularmente, se analizará el papel preciso del efecto de Te y de Zn, además de evaluar las posibles influencias transgeneracionales que estos elementos puedan tener. Estos objetivos pretenden alcanzarse, utilizando compuestos donde el único elemento responsable es el que se pretende estudiar. Se trabajará con K2TeO3 para evaluar Te; ZnCl2 para evaluar Zn y ZnTe para estudiar la interacción de Zn y Te, aspectos que aún no están totalmente esclarecidos.Las evidencias a generarse con el desarrollo de este proyecto, permitirá comprobar y completar los efectos de los elementos traza y su importancia como componentes ambientales en las comunidades humanas donde la geografía natural directamente expone estos elementos a las personas.

Palabra claves: Teluro, elementos traza, cognición

Previous evidence from this laboratory has shown that the inorganic chemical elements, such as Zn and Te were able to modify the normal behavioural expression of some higher brain functions in the rat in a similar way to that found in humans. Three important parameters were affected; cognitive behavioural, social interaction, and survival responses.The present project, continuing the research line of previous work aims to get additional evidence to the concept that trace elements are epigenetic modulators of coping behaviour in the rat. Particularly, the precise role of Te and Zn on these brain mechanisms, in addition to its possible influence on transgenerational effects will be analyzed, since these aspects are not yet completely understood. These objectives will be performed using chemical compounds where the only active elements will be Zn or Te (K2TeO3 and ZnCl2). It is expected that results from this study will complement and characterize the biological effects of trace elements in organisms, putting in perspective its projections to those people living in geographical zones where exposition to trace elements is unavoidable.

Keywords: tellurium, trace elements, cognition

Evolucion de la prevalencia de estudiantes consumidores de sustancias adictivas y de las dosis utilizadas desde el inicio hasta la finalizacion de los estudios de grado en facultades de la UNCuyo.

Palabra claves: adicciones, prevalencias, riesgos

Prevalence evolution of adictive substances users and doses used from begining to ending universitary studies in schools of the UNCuyo.

Keywords: adictions, prevalence, risks

Trypanosoma cruzi es el agente causal de la enfermedad de Chagas. Este parásito tiene un ciclo de vida complejo que incluye una etapa intracelular en mamíferos susceptibles a la infección. La invasión por este parásito da lugar a cambios drásticos en la expresión de genes de la célula huésped tendientes a favorecer la proliferación intracelular del mismo y en definitiva su diseminación por todo el organismo. A pesar del creciente avance en el estudio de estos cambios a nivel transcripcional, nada se sabe de la maquinaria molecular por la cual esto ocurre. En este proyecto nos proponemos estudiar los mecanismos de regulación de la expresión génica involucrados en este fenómeno y su relación con los cambios morfológicos del parásito. En definitiva, indagaremos si existen cambios epigenéticos, específicamente metilación de ADN, y en el perfil de expresión de microARNs a distintos tiempos posinfección. Para lograr este pretencioso objetivo utilizaremos técnicas de biología molecular como methylation specific-multiplex ligation-dependent probe amplification (MS-MLPA) y secuenciación masiva de microARNs. Esperamos encontrar así nuevos mecanismos (metilación de ADN) y moléculas (microARNs) de la célula huésped involucrados en la invasión y proliferación intracelular de T. cruzi susceptibles a intervención farmacológica.

Palabra claves: Parasitología, Epigenética, microARNs

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease. This parasite has a complex life cycle that includes an intracellular stage in mammals susceptible to infection. The parasite invasion leads to extensive changes in host cell gene expression aimed to favor the intracellular proliferation and thus its spread throughout the body. Despite the considerable advances in the study of transcriptional changes, little attention has been paid to the molecular basis by which these occurs. In this project we propose to study the mechanisms of regulation of gene expression involved in this phenomenon and its relationship with developmental stages of the parasite. Ultimately, we will seek for epigenetic changes, specifically DNA methylation, and microRNAs deregulation at various times post-infection. To achieve this pretentious objective we will take advantage of molecular biology techniques such as methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification (MS-MLPA) and microRNAs massive sequencing. Thus, we hope to find new druggable host cell mechanisms (DNA methylation) and molecules (microRNAs) involved in cellular invasion and proliferation of T. cruzi.

Keywords: Parasitology, Epigenetics, microRNAs

El transporte intracelular mediado por vesículas es un proceso altamente dinámico que permite el tráfico y reciclaje entre distintos compartimientos membranosos. El principal objetivo de este proyecto es determinar a nivel molecular la maquinaria que regula ciertos eventos específicos relacionados con la vía autofágica. La autofagia es un proceso que involucra la degradación de organelas y de otros elementos del citoplasma permitiendo el reciclaje de aminoácidos y de otros componentes. Es nuestro propósito avanzar en el estudio de la relación entre la autofagia y la supervivencia de ciertos microorganismos patógenos tales como Mycobacterium tuberculosis y marinum, Coxiella burnetii, Staphylococcus aureus. Se determinarán las señales específicas y los mecanismos por los cuales la célula huésped reconoce y dirige a ciertas bacterias hacia la vía autofágica o cómo ciertos microorganismos modulan dicha vía. Nuestra finalidad es continuar con la identificación de los componentes moleculares que regulan estos procesos analizando principalmente el papel que cumplen las proteínas Rabs así como otras GTPasas y proteínas asociadas. Para ello se utilizarán proteínas mutadas y siRNA dirigidos contra las mismas. Comprender a nivel molecular el funcionamiento de la vía autofágica no sólo en procesos fisiológicos normales sino también en diversas procesos infecciosos nos permitirá establecer nuevas estrategias para el diseño de drogas con propiedades terapéuticas.

Palabra claves: Autofagia, Fagocitosis, microorganismos

Vesicular trafficking is a highly dynamic process involved in transport and recycling of molecules among different intracellular compartments. The goal of this project is to determine at the molecular level the machinery that regulates events related to the autophagic pathway. Autophagy is a cytoplasmic degradative process by which organelles, long-lived proteins and other cytoplasmic components are recycled. Our goal is to advance in the study of the role of the autophagic pathway in the survival of microorganisms such as Mycobacterium tuberculosis, M. marinum, Staphylococcus aureus, Coxiella burnetii. Specifically our aim is to determine the signals and molecules involved in targeting certain bacteria to autophagy and how the pathway is modulated by the pathogen. Our objective is to analyze the role of proteins from the Rab family and their interacting proteins as well as other GTPases in these processes. For this purpose we will use mutants and siRNA directed against the proteins of interest. Unraveling the role of autophagy at the molecular level in different physiological or pathological processes, such as the one induced by intracellular microorganisms, will allow us to design new strategies for the treatment of worldwide important infectious diseases for both humans and animals.

Keywords: Autophagy, Phagocytosis, Pathogens

La exocitosis regulada es un evento celular calcio dependiente donde vesículas secretorias fusionan con la membrana plasmática. El espermatozoide exocita su gránulo secretorio (acrosoma) frente a diferentes estímulos. Este proceso se denomina reacción acrosomal (RA) y es requerida para la penetración de la zona pelúcida del ovocito y por lo tanto, para la fertilización. La RA es un modelo privilegiado para estudiar las moléculas que intervienen en la exocitosis ya que permite esclarecer vías de señalización que si bien operan en una variedad de células exocíticas, son difíciles de desentrañar cuando la exocitosis se superpone con fenómenos de transporte de membranas ausentes en la gameta madura. Proponemos que los lípidos se encuentran formando dominios dinámicos cuyo reordenamiento es necesario para que ocurran fenómenos que implican fusión de membranas como la RA. Nos focalizaremos en una molécula lipídica esencial y decisiva para que ocurra la exocitosis: el fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2). La proteína Tat del HIV-1 se une a PIP2 con elevada afinidad. Es secretada por las células infectadas (Por ej., leucocitos del semen) y atraviesa las membranas intactas de células no infectadas. En este proyecto proponemos: I) Dilucidar si Tat es capaz de ingresar a los espermatozoides humanos; II) Determinar si Tat afecta la exocitosis acrosomal, si es así, evaluar si el efecto se debe a que une PIP2; III) Elucidar cuál es la dinámica de los dominios de PIP2 durante la fusión de membranas; IV) Evaluar si dicha proteína afecta la motilidad espermática. Esperamos obtener información relevante que permita hacer aportes a la medicina clínica, esclareciendo aspectos desconocidos de la infección por virus de HIV. Para resolver estos interrogantes afectaremos la función de componentes de la cascada de señalización adicionando a las gametas lípidos, proteínas recombinantes permeables o no, anticuerpos, segundos mensajeros y mediremos su influencia en la exocitosis. Los resultados se analizarán a través de ensayos bioquímicos, funcionales y morfológicos. Utilizaremos técnicas de microscopía de avanzada (con sondas fluorescentes) para analizar la dinámica y topología de la exocitosis y las fluctuaciones en la concentración de calcio intracelular. Nuestra propuesta pretende develar cómo los diferentes lípidos que constituyen las membranas participan activamente en el proceso de fusión cumpliendo un rol específico.

Palabra claves: EXOCITOSIS ACROSOMAL, LÍPIDOS, HIV

Regulated exocytosis is a calcium-dependent cellular event where secretory vesicles fuse with the plasma membrane. The acrosome is a membrane-limited granule that overlies the sperm nucleus. In response to physiological or pharmacologic stimuli, sperm undergo exocytosis of this granule in a calcium-dependent manner termed the acrosome reaction. This process is necessary for fertilization. Considering that exocytosis share molecules with other intracellular transport mechanisms, the spermatozoon provides an ideal system to study this phenomenon because it does not possess endoplasmic reticulum or Golgi apparatus, and evinces no endocytosis or other types of intracellular transport, allowing us to study the exocytic process in isolation. We hypothesize that lipids are organized in dynamic domains that undergo remodeling after membrane fusion during the acrosome reaction. We will focus on phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2), an essential and decisive lipid for acrosomal exocytosis. Recent studies demonstrated that HIV-1 Tat protein binds PIP2 with high affinity. Tat is a regulatory protein that enhances viral transcription and replication. It is a basic protein secreted unconventionally by infected cells (e.g. LT present in semen) and it permeates the membranes of non-infected cells, usually by endocytosis. The general goal of this proposal is to characterize if HIV-1 Tat can permeate the sperm membrane, affect human sperm exocytosis, and consequently fertility. This project pursues the following specific aims I) To elucidate if Tat protein translocate human sperm membranes affecting acrosomal exocytosis; II) To determine if Tat effect in the acrosome reaction is due to PIP2 binding that blocks its function; III) To elucidate the dynamic of PIP2 domains during membrane fusion; IV) To evaluate if the protein affects the sperm motility. Here, a multidisciplinary approach will be applied to solve this riddle such as biochemical, functional, and high-resolution imaging perspectives. We hypothesize that the Tat present in the seminal plasma is able to translocate human sperm membranes impairing the acrosomal exocytosis. We expect in a near future to analyze Tat?s role in sperm of HIV patients extrapolating this basic research to the clinical practice and elucidating unknown aspects of HIV virus infection.

Keywords: ACROSOMAL EXOCYTOSIS, LIPIDS, HIV